KO first小鼠模型構(gòu)建

簡(jiǎn)要描述：

KO first小鼠模型構(gòu)建：KO-first（又稱“條件性-ready“）是一種多功能基因打靶策略，可在同一模型中實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)敲除（KO）、條件性敲除（cKO）和過(guò)表達(dá)（KI）三種功能。該模型由歐盟小鼠突變計(jì)劃（EUCOMM）和國(guó)際小鼠表型聯(lián)盟（IKMC）推廣，是系統(tǒng)化研究基因功能的強(qiáng)大工

更新時(shí)間：2025-06-26

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產(chǎn)品介紹

KO first小鼠模型構(gòu)建

一、KO-first 載體設(shè)計(jì)原理

KO-first載體通過(guò)精巧的基因陷阱（Gene Trap）和條件性模塊設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)"三位一體"功能：

野生型基因

KO-first等位基因

傳統(tǒng)KO

條件性KO

報(bào)告基因過(guò)表達(dá)

核心元件：

5'同源臂（1.5-3 kb）
SA-βgeo-pA（剪接受體-β半乳糖苷酶/新mei素抗性融合基因）
floxed 關(guān)鍵外顯子（通常第2-4號(hào)外顯子）
3'同源臂（1.5-3 kb）
FRT-flanked NeoR（用于陽(yáng)性篩選，后續(xù)可切除）

二、KO first小鼠模型構(gòu)建流程（以ES細(xì)胞同源重組為例）

1. 靶向載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)要點(diǎn)：

關(guān)鍵外顯子兩側(cè)插入loxP位點(diǎn)（間距通常1-2 kb）
在5'UTR插入SA-βgeo實(shí)現(xiàn)基因陷阱（組成型KO）
NeoR兩側(cè)加入FRT位點(diǎn)便于后續(xù)Flp刪除

改造

野生型基因: Exon1-Exon2-Exon3

KO-first等位基因: SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-FRT-NeoR-FRT

2. ES細(xì)胞打靶

電轉(zhuǎn)與篩選：

線性化載體電轉(zhuǎn)至JM8A3.N1等ES細(xì)胞
G418（NeoR）陽(yáng)性篩選7-10天

克隆驗(yàn)證：

5'端PCR：F1（同源臂外側(cè)） + R1（βgeo內(nèi)）
3'端PCR：F2（NeoR內(nèi)） + R2（同源臂外側(cè)）
Southern blot確認(rèn)單拷貝整合

3. 獲得嵌合體小鼠

囊胚注射：將陽(yáng)性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚
嵌合體鑒定：毛色嵌合（129Sv ES細(xì)胞→B6背景）

4. 傳代與品系建立

第一步交配：嵌合體（公鼠）× WT（母鼠）

獲得F1代（SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP，NeoR+）

第二步交配：F1 × Flp deleter小鼠（刪除NeoR）

獲得"clean" KO-first小鼠（僅保留SA-βgeo和loxP）

三、三種應(yīng)用模式切換

1. 傳統(tǒng)KO（組成型敲除）

機(jī)制：SA-βgeo阻斷基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能wan全喪失
驗(yàn)證方法：

β-gal染色（報(bào)告基因表達(dá)）
Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白缺失

2. 條件性KO（組織特異性敲除）

交配策略：

× Cre

KO-first

cKO

關(guān)鍵點(diǎn)：

Cre介導(dǎo)的loxP重組刪除floxed外顯子
需驗(yàn)證目標(biāo)組織中的敲除效率（qPCR/免疫組化）

3. 報(bào)告基因過(guò)表達(dá)

利用SA-βgeo：

β-gal活性反映內(nèi)源基因表達(dá)模式
可用于細(xì)胞譜系追蹤

4. 恢復(fù)野生型（可選）

與Flp deleter小鼠交配可刪除SA-βgeo，恢復(fù)野生型等位基因

四、技術(shù)優(yōu)勢(shì)與局限性

優(yōu)勢(shì)	挑戰(zhàn)
一個(gè)模型實(shí)現(xiàn)三種功能	載體構(gòu)建復(fù)雜（需專業(yè)設(shè)計(jì)）
避免多品系重復(fù)構(gòu)建	ES細(xì)胞打靶周期長(zhǎng)（6-12個(gè)月）
國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化（IKMC資源可獲?。?/p>	βgeo可能影響鄰近基因表達(dá)